## 培养条件

培养条件为气相：95%空气与5%二氧化碳；温度设定为37℃。在传代时，第一次建议采用1:2的比例。传代后的情况需在2天内更换培养液。为了确保操作顺利，建议同时购买完培产品，享受优惠。

细胞收到后，处理时需先培养到良好状态，再将完全培养液灌满并封好瓶口，这样是运输细胞的最佳方法。收到细胞后，用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，同时在超净台内保持无菌操作，随后将细胞瓶放入37℃、5% CO₂的培养箱中静置3-4小时，以确保细胞状态稳定。

通过显微镜观察细胞的生长情况，并对细胞样本进行不同倍数拍照保存（建议40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，若照片未提供，则默认收到的细胞状态良好。

## 细胞培养步骤

### a. 细胞传代

若细胞未超过80%的汇合度，则收集瓶中的完全培养液至离心管中，留5ml完全培养基，再放入37℃、5% CO₂箱中培养；若细胞密度超过80%，即可进行传代培养。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，随后在显微镜下观察细胞状态，若细胞大部分变圆并脱落，迅速迁回操作台，轻拍培养瓶并添加5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使完全脱落后吸出，转移到15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，再补加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO₂的培养箱中继续培养。

### b. 悬浮细胞传代

1. 半换液法：将培养瓶竖置于培养箱内静置约1小时，轻轻吸掉约3ml培养基，再补充3ml完全培养基。如果培养基变色较慢，可直接添加约500ul FBS，传代时直接补充5ml培养基，分成两个培养瓶，通常进行3次左右的传代后可离心传代一次以去掉死细胞。

2. 离心换液法：如需分瓶，将细胞悬液收集到离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬混匀，然后将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按说明书要求配置的新完全培养基以维持细胞生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

## 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液并用PBS清洗细胞一次。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞状态，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打以使细胞脱落，然后转移悬液至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存，若后期需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐。

## 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护装备），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶后，擦拭冻存管外壁以确保无菌。

2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

## 注意事项

在运输过程中，某些细胞可能会因为贴壁不牢而发生脱落，这是正常现象。如脱离较多，可以将培养瓶中所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5分钟，利用收集的上清进行过渡培养（后期对比培养）。沉淀后加入1-2ml胰酶轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后，添加5ml完全培养基终止反应。再离心，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

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